۲-۶ معرفی تعدادی از روش­های شناسایی و تحلیل ساختار شیمیایی پلی­ساکارید
۲-۶-۱ کروماتوگرافی گازی
کروماتوگرافی در برگیرنده گروهی از روش­های مهم و گوناگونی است که به دانشمندان اجازه می­دهد تا اجزای یک مخلوط پیچیده را از یکدیگر جدا کرده و هویت آن­ها را مشخص کنند. اصطلاح کروماتوگرافی، به دلیل اینکه در برگیرنده تکنیک­های مختلفی است، به طور مشخص قابل تعریف نیست اما در تمام این روش­ها یک فاز ساکن و یک فاز متحرک وجود دارد و اجزای یک مخلوط به وسیله جریانی از یک فاز متحرک که از داخل یک فاز ساکن عبور می­ کند، بر اساس اختلاف در سرعت مهاجرت اجزای مختلف نمونه، جدا سازی می­شوند (اسکوگ^[۷۲]، ۱۹۱۸).
در کروماتوگرافی گازی نمونه تبخیر شده، و به سر ستون کروماتوگرافی تزریق می­ شود. شویش با جریانی از فاز متحرک گازی بی­اثر انجام می­ شود. در کروماتوگرافی گازی، فاز متحرک با مولکول­های آنالیت برهم کنشی ندارد و فقط به عنوان وسیله­ای برای انتقال مولکول­ها از داخل مواد پرکننده عمل می­ کند. به طور کلی یک کروماتوگراف گازی شامل مخزن گاز حامل (گاز­های حامل متداول: هلیم، آرگون، هیدروژن و نیتروژن)، سیستم تزریق نمونه، ستون و آشکارساز می­باشد که زمان خروج مواد از ستون کروماتوگرامی را ثبت خواهد کرد و بر اساس زمان خروج و سطح زیر نمودار، نوع و مقدار ماده را برآورد خواهیم کرد (اسکوگ، ۱۹۱۸).

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۶-۲ طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR^[73])
طیف سنجی مادون قرمز یکی از روش­های خوب و متداولی است که از سال­ها پیش برای تجزیه و شناسایی مواد مورد استفاده قرار گرفته است. فرکانس تشعشع الکترو مغناطیس در ناحیه مادون قرمز(IR) مطابق با فرکانس ارتعاش طبیعی اتم­های یک پیوند است و پس از جذب امواج مادون قرمز در یک مولکول، باعث ایجاد یک سری حرکات ارتعاشی در آن می‌شود که اساس و مبنای طیف ‌سنجی مادون قرمز را تشکیل می‌دهد. ساده­ترین نوع حرکات ارتعاشی در یک مولکول، حرکات خمشی و کششی است. تقریباً تمامی ترکیباتی که پیوند کوالانسی دارند، اعم از آلی یا معدنی، فرکانس‌های متفاوتی از اشعه الکترو­مغناطیس را در ناحیه مادون قرمز جذب می‌کنند. ناحیه مادون قرمز، ناحیه‌ای از طیف الکترو­­مغناطیس است که طول موجی بلندتر از نور مرئی (۴۰۰ تا ۸۰۰ نانومتر) و کوتاه ‌تر از امواج مایکروویو (طول موج بلندتر از۱میلی­متر) دارد. بسیاری از شیمیدان­ها از واحد «عدد موجی» در ناحیه مادون قرمز طیف الکترو­مغناطیس استفاده می‌کنند. عدد موجی با واحد Cm^-1 بیان شده و عبارت است از عکس طول موج. مزیت این واحد این است که رابطه مستقیمی با انرژی دارد. مهمترین قسمت عملی این طیف، ناحیه بین Cm^-1 ۴۰۰۰-۴۰۰ می­باشد. مشابه دیگر انواع جذب انرژی، هنگامی که مولکول‌ها اشعه مادون قرمز را جذب می­ کنند، به حالت انرژی بالاتر برانگیخته می‌شوند.
جذب تابش مادون قرمز همانند دیگر فرآیندهای جذب، فرایندی کوانتایی است. به این صورت که فقط فرکانس‌های خاصی از تابش مادون قرمز توسط مولکول جذب، و باعث ارتعاش کششی و خمشی پیوندهای کوالانسی می‌شود. انرژی جذب شده از نور مادون قرمز توسط پیوندهای شیمیایی یا گروه‌های عاملی خاص در طول موج مشخص، منجر به کاهش شدت عبور نور شده و معمولاً به عنوان تابعی از عدد موجی (بر­حسبCm^-1) رسم می­ شود. توجه به این نکته مهم است که تمام پیوندهای مولکول قادر به جذب انرژی مادون قرمز نیستند، حتی اگر فرکانس اشعه با فرکانس حرکت تطبیق کند، فقط پیوندهایی که دارای گشتاور دو قطبی هستند قادر به جذب اشعه مادون قرمز می­‌باشند. مثلاً، پیوند موجود در H₂ و Cl₂ و هم چنین پیوند­های موجود در آلکن­ها و آلکین‌های متقارن، اشعه مادون قرمز را جذب نمی‌­کنند. باید توجه داشت که هر پیوند دارای فرکانس ارتعاش طبیعی خاصی است. یعنی یک پیوند خاص با جذب فرکانسی مشخص قادر به ارتعاش کششی است. یک پیوند، به‌ خصوص در دو مولکول مختلف، در محیط­های متفاوتی از نظر اتم­ها و پیوندهای پیرامونی خود قرار داشته و هیچ­گاه دو مولکول با ساختمان‌های متفاوت، طیف مادون قرمز یکسانی نمی­دهند. با توجه به این مطلب، از طیف مادون قرمز می‌توان همانند اثر انگشت در انسان، برای شناسایی مولکول­ها استفاده کرد. با مقایسه طیف مادون قرمز دو ماده که تصور می­ شود مشابه باشند، می ‌توان پی برد که آیا واقعاً یکی هستند یا خیر. اگر تمام جذب‌ها در طیف دو نمونه بر یکدیگر منطبق شوند، به احتمال قریب به یقین، دو ماده یکسان هستند. طیف FTIR علاوه بر موارد گفته شده، اطلاعاتی را در مورد ساختمان شیمیایی یک مولکول، در اختیار ما می ‌گذارد. مثلاً، هر جذبی که در ناحیه Cm^-1 ۱۵۰±۳۰۰۰ طیف قرار داشته باشد، نشان‌دهنده وجود اتصال C-H در مولکول است و جذبی که در ناحیه Cm^-1 ۱۰۰±۱۷۰۰ مشاهده شود معمولا مربوط به پیوند گروه کربونیل در مولکول است.
به طور کلی، پیوندهای سه گانه، قوی‌تر از پیوندهای دوگانه و یا ساده بوده و دارای فرکانس ارتعاشی بالاتر یا به بیانی بهتر و با عدد موجی بالاتر هستند. پیوند C-C دارای فرکانس جذب Cm^-1 ۱۲۰۰ بوده در حالی‌ که پیوند دوگانه C=C فرکانس جذب Cm^-1 ۱۶۵۰ و پیوند سه‌گانه C≡C دارای فرکانس جذب Cm^-1 ۲۱۵۰ است و یا در مثالی دیگر، عدم وجود باند جذبی در ناحیه Cm^-1 ۱۸۵۰-۱۵۴۰ عدم حضور عامل کربونیل را در ساختمان مولکولی می­­رساند. هم چنین حرکت خمشی راحت­تر از حرکت کششی صورت می ‌پذیرد. مثلا، C-H خمشی در ناحیه Cm^-1 ۱۳۴۰ و C-H کششی در ناحیه Cm^-1 ۳۰۰۰ قرار می‌گیرد.
طیف مادون قرمز را می­توان برای گاز­ها، مایعات و یا جامدات به دست آورد. به طور خلاصه، طیف گاز­ها و مایعات فرار را می­توان با انبساط نمونه در یک سل تخلیه شده، طیف مایعات را با فشار دادن نمونه مایع بین دو سطح مستوی و ایجاد فیلمی با ضخامت کم، و ترکیبات جامد را معمولاً به صورت سوسپانسیون در روغن­های با وزن مولکولی زیاد، به شکل قرصی فشرده و یا به صورت فیلم شیشه ­ای رسوبی مورد بررسی قرار داد (سیلوراشتین^[۷۴] و همکاران، ۱۹۶۳).
۲-۷ روش سطح پاسخ (RSM^[75])
RSM مجموعه ­ای از تکنیک­های آماری است که در بهینه­سازی فرایند­هایی بکار می­رود که پاسخ مورد نظر توسط تعدادی از متغیر­ها تحت تأثیر قرار می­گیرد. شمای گرافیکی مدل ریاضی سبب تعریف واژه روش سطح پاسخ شده است (لی و همکاران، ۲۰۰۷). محدوده کاربرد طرح آماری بسیار گسترده است و در اغلب زمینه­ ها به منظور بهینه سازی شرایط عمل از آن استفاده می­ شود (مایرز^[۷۶] و همکاران، ۱۹۹۲). با کمک طرح آماری RSM می­توان به اهداف زیر دست یافت:
۱. کلیه ضرایب مدل رگرسیون درجه دوم با کمک این طرح قابل برآورد هستند.
۲. تعداد آزمایش ها کاهش می­یابد.
۳. اثر متقابل فاکتور­ها بر روی نتایج حاصل از آزمایش­ها بررسی می­گردد.
۴. امکان آزمون عدم برازش (Lack of fit) را فراهم می سازد.
۵. مقادیر بهینه فاکتور­­ها ر ا می­توان با کمترین تعداد آزمایش تخمین زد (ماهرانی و همکاران، ۱۳۸۳).
۲-۸ مروری بر پژوهش­های انجام شده
۲-۸-۱ مروری بر پاره­ای از پژوهش­های انجام شده بر اثر ضد اکسایشی و ضد­میکروبی پلی­ساکارید و عصاره گیاهان
مطالعات زیادی بر گیاهان گوناگون و به ویژه اسانس و عصاره آن­ها انجام شده و فعالیت ضد­اکسیدانی و ضد­میکروبی آن­ها مورد بررسی بسیار قرار گرفته است. در سال­های اخیر استخراج پلی­ساکارید از گیاهان دارویی و بررسی ویژگی­های ضد­اکسیدانی و ضدمیکروبی آن­ها مورد توجه بسیاری از محققین قرار گرفته است. در زیر به تعدادی از آن­ها اشاره خواهد شد.
استخراج پلی­ساکارید از برگ گیاه پاریس پلیفیلا به روش سوکسله انجام شد و نتایج حاصل نشان دادند که این پلی ساکارید دارای خواص ضد­اکسیدانی قوی می­باشد (شن^[۷۷] و همکاران، ۲۰۱۴). استخراج پلی­ساکارید از دانه گیاه فاربیتیس نیل^[۷۸] با بهره گرفتن از روش اولتراسونیک در نسبت آب به ماده خام ۵/۶ میلی­لیتر بر گرم، دمای استخراج ۴۹ درجه سانتی ­گراد، قدرت مافوق صوت ۶/۶۱ وات و زمان استخراج ۶/۳۲ دقیقه انجام گرفت و خواص ضد­اکسیدانی استثنایی و وابسته به غلظت را نشان داد (وانگ^[۷۹] ، ۲۰۱۴). تحقیقات نشان داده­اند گیاه بروگیورا جیمنوریزا^[۸۰] دارای خواص ضد­تب، ضد­اسهال و ضد­باکتریایی می­باشد و در طب سنتی چین جایگاه ویژه­ای دارد. در این مطالعه پلی­ساکارید برگ این گیاه استخراج شده و مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاکی از آن است که پلی­ساکارید حاصل دارای فعالیت ضد­اکسیدانی قابل ملاحظه­ای بوده و توانایی مهار رادیکال­های آزاد بالایی دارد (لی^[۸۱] و همکاران، ۲۰۱۳). پلی­ساکارید دانه گیاه آمومیوم ویلسوم^[۸۲] استخراج و خالص سازی شده و به وسیله کروماتوگرافی سه جزء آن از هم تفکیک گردید. جزء سوم پلی­ساکارید^[۸۳] دارای وزن مولکولی بالاتر و درصد پروتئین بیشتری نسبت به دیگر اجزا می­باشد و اثر بازدارندگی بیشتری بر رشد سلول­های سرطانی کبد نشان می­دهد. همچنین پلی­ساکارید حاصل از این گیاه تأثیر قابل توجهی در مهار رادیکال­های آزاد در شرایط آزمایشگاهی نشان داده، از تشکیل مالون­دی­آلدهید جلوگیری کرده و باعث افزایش فعالیت آنزیم­ های ضد­اکسیدانی در برابر تتراکلرید­کربن در سلول­های کبدی آسیب دیده موش گردید (ژانگ^[۸۴]، ۲۰۱۳). تکنیک اولتراسونیک یک روش بسیار مفید برای استخراج پلی­ساکارید از گیاه آکنتوپاناکس­سنتیکوسوس ^[۸۵] بوده است. پلی­ساکارید به دست آمده توانایی آنتی­اکسیدانی بالایی از خود نشان داده و می­توان از آن در پزشکی و غذا­­های غنی شده با مواد مؤثر بر سلامت انسان (غذا­های عملکردی^[۸۶]) استفاده نمود.
میوه گیاه لشیوم روتنیکوم^[۸۷] تحت تیمار به روش مایکروویو قرار گرفته و پلی­ساکارید آن استخراج گردید. آزمون­های مهار ۲و۲-­­­­دی­فنیل­-۱-­­پیکریل­هیدرازیل^[۸۸]، پراکسید­­هیدروژن و مهار رادیکال­های سوپر­اکسید بر روی آن انجام شد. نتایج نشان دادند این پلی­ساکارید قابلیت کاربرد به عنوان ضد­اکسیدان را در درمان­های پزشکی و مواد غذایی عملکردی دارا می­باشد (لیو^[۸۹] و همکاران، ۲۰۱۳). مطالعه فعالیت ضد­اکسیدانی پلی­ساکارید حاصل از گیاه پاناکس ژاپنیکوس سی.آ مایر^[۹۰] ، از جمله آزمون­های مهار ۲و۲-دی­فنیل-۱-پیکریل­هیدرازیل، پراکسید­هیدروژن و مهار رادیکال­های سوپر­اکسید، فعالیت ضد­اکسیدانی خوبی نشان داد (وانگ^[۹۱] و همکاران، ۲۰۱۲). در مطالعه­ ای، برگ­های بلوط از کوه­های زاگرس^[۹۲] جمع آوری شده و پلی­ساکارید آن با بهره گرفتن از اولتراسونیک استخراج گردید. نتایج آزمون­ها در شرایط آزمایشگاهی نشان داد، پلی­ساکارید حاصل، توانایی خوبی در مهار رادیکال­های هیدروکسیل و ۲و۲-دی­فنیل-۱- پیکریل­هیدرازیل داشته و علاوه بر آن فعالیت ضد­میکروبی خوبی در غلظت ۵/۲-۵/۱ میلی­گرم بر میلی­لیتر نشان داده است. فعالیت ضد­میکروبی این پلی­ساکارید بر سالمونلا­تیفی، استافیلوکوکوس اورئوس ، کاندیدا­آلبیکانس و پنیسیلیوم­سیتری^[۹۳] بررسی شد. قطر هاله تشکیل شده در منطقه بازدارندگی برای میکروارگانیسم­های مختلف، متفاوت است و نتایج ، حاکی از آن است که پلی­ساکارید استخراج شده از برگ بلوط می ­تواند به عنوان ماده ضد­اکسیدان و ضد­میکروبی در صنعت غذا و دارو استفاده شود (تهموزی^[۹۴]، ۲۰۱۴). همچنین در پژوهش مشابهی، فعالیت ضد­اکسیدانی و ضد­میکروبی پلی­ساکارید خالص استخراج شده از گیاه سرخس^[۹۵] مورد بررسی قرار گرفت. این پلی­ساکارید توانایی خوبی در مهار رادیکال­های پراکسید ، ۲و۲-دی­فنیل-۱-پیکریل­هیدرازیل، مهار پراکسید هیدروژن و شلاته کردن فلزات، داشته است. مقایسه آن با استاندارد آسکوربیک­اسید توانایی ضد­اکسیداسیون خوبی را نشان می­دهد. همچنین در بررسی فعالیت ضد­میکروبی آن، بیشترین تاثیر بر هانسنولا آنامالا^[۹۶] و کاندیدا آلبیکانس^[۹۷] دیده شد و تأثیر قابل توجهی در جلوگیری از رشد سالمونلا­تیفی و اشرشیا­کلی مشاهده گردید. این پلی­ساکارید فعالیت ضد­میکروبی و ضد­اکسیدانی خوبی در شرایط آزمایشگاه نشان داده اما استفاده از آن نیاز به بررسی فعالیت آن در سیستم زیستی دارد (لی^[۹۸]، ۲۰۰۶).
اخیراً فعالیت­های بیولوژیک و ضد­تومور پلی­ساکاریدهای حاصل از قارچ­ها، گیاهان و میکروارگانیسم­ها بسیار مورد توجه قرار­گرفته­ (تانگ^[۹۹] و همکاران، ۲۰۰۹)، و علاوه بر آن خواص ضد ویروسی، ضد­اکسایشی و ضد انعقاد آن­ها در بسیاری موارد به اثبات رسیده است (هی^[۱۰۰] و همکاران، ۲۰۱۰). بسیاری از محققان با ظهور باکتری­هایی که به چند نوع آنتی­بیوتیک مقاوم هستند، برای پیشگیری از فساد و مسمومیت غذایی دچار چالش شده ­اند، بنابراین توسعه تولید ترکیباتی که میکروارگانیسم­ها قادر به مقاومت در برابر آن­ها نباشند، یک نیاز مهم می­باشد (الکشان و لوی^[۱۰۱]، ۲۰۰۷).
در همین راستا پلی­ساکارید جدیدی از مایع سلولی استرپتومایسس ویرجینیا استخراج گردیده و اثر ضد­میکروبی آن بر میکروارگانیسم­هایی چون استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتلیس، لیستریا مونوسیتوژنز، اشرشیا­کلی، زیگوساکارومایسس­­بایلی و کاندیدا­یوتیلیس مورد بررسی قرار گرفت. در آزمون آنتی­بیوگرام، قطر منطقه بازداری برای باسیلوس سوبتلیس، استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسیتوژنز و اشرشیا­کلی به ترتیب ۵/۳۸، ۴/۳۷، ۸/۳۶ و ۴۰ میلی­متر، و برای مخمر زیگوساکارومایسس­­بایلی ۵/۲۸ میلی­متر گزارش شد. منطقه بازداری در آزمون آنتی­بیوگرام پلی­ساکارید وسیع­تر از نیسین گزارش شده است. در بخشی از این مطالعه استافیلوکوکوس­اورئوس توسط این پلی­ساکارید تحت تیمار قرار­گرفت. عکس­های گرفته شده با میکروسکوپ نوری نشان می­دهد که دیواره سلول آسیب دیده، شکسته شده و سلول­ها چروکیده و چسبیده به یکدیگر هستند که می ­تواند به علت نشت محتویات سلولی باشد. این در حالیست که تیمار این باکتری با نشاسته در غلظت مشابه، تاثیری بر شکل سلول نداشته ­است. همچنین خاصیت ضد­میکروبی پلی­ساکارید در برابر استافیلوکوکوس­اورئوس، بعد از تیمار حرارتی (Cº ۱۰۰- ۶۰) به­مدت ۱۰ دقیقه، بدون تغییر باقی ماند. این در حالیست که فعالیت ضد­میکروبی نیسین در همین شرایط به ۵۰ % کاهش یافت که نشان از ثبات حرارتی بالای پلی­ساکارید دارد (هی و همکاران، ۲۰۱۰).
۲-۸-۲ مروری بر پژوهش­های انجام شده برجنس ویبورنوم
جنس ویبورنوم با توجه به مورفولوژی (ریخت شناسی) و ریشه ­های جغرافیایی آن در یازده دسته طبقه ­بندی می­ شود.
گونه­ های ویبورنوم به بیش از ۲۳۰ گونه تقسیم می­شوند و اغلب به عنوان گیاه زینتی و یا برای استفاده از میوه آن­ها پرورش داده می­شوند. اکثر گونه­ های ویبورنوم بومی هستند به عنوان مثال Viburnum opulus واریته opulus به­ طور گسترده­ای در غرب، مرکز، شرق و شمال شرق اروپا و گونه V. opulus واریته sargentii بومی شرق دور از جمله کره، شمال چین و ژاپن می­باشد (سیسونین^[۱۰۲] و همکاران، ۲۰۱۰).
گونه ای از جنس ویبورنوم با نام علمی Viburnum opulus L. در اروپا و آمریکا با نام Cranberrybush شناخته می­ شود. میوه­ ها و پوست این درخت به­ طور گسترده­ای در داروشناسی استفاده می­ شود. مردم اروپا، آسیا و بومیان آمریکا از این گیاه برای رفع اسپاسم استفاده می­ کنند. همچنین برای تسکین درد، کاهش تب، درمان سرما­خوردگی، سرفه، عفونت رحم، فشار­خون بالا و ناباروری مورد استفاده قرار می­گیرد خواص ضد­میکروبی عصاره میوه ویبورنوم اپیلوس و روغن دانه آن در برخی تحقیقات به اثبات رسیده است (ییلماز^[۱۰۳] و همکاران، ۲۰۰۸).
گزارش شده میوه­ بعضی از گونه­ های ویبورنوم حاوی میزان زیادی پلی­فنول (سیسونین و همکاران، ۲۰۱۰)، آنتوسیانین­ها (جوردهم^[۱۰۴] و همکاران، ۲۰۰۷) و اسید­های آلی چون آسکوربیک (سیسونین و همکاران، ۲۰۱۰) و L- مالیک اسید (کیم و هیزول^[۱۰۵]، ۲۰۰۷) می­باشند. مطالعات انجام شده بر روی میوه و عصاره برخی گونه­ های ویبورنوم در شرایط آزمایشگاهی، تأثیرات آنتی­اکسیدانی آن­ها را تأیید کرده است (ساگدک^[۱۰۶] و همکاران، ۲۰۰۶).
مطالعات انجام شده بر مواد زیست فعال موجود در میوه Viburnum opulus L.، بر خواص ضد­میکروبی مؤثر آن­ها در برابر پاتوژن­های باکتریایی انسان دلالت می­ کنند، این در حالی است که مخمر­ها نسبت به این مواد حساسیت بسیار کمی نشان داده­اند (سیسونین و همکاران، ۲۰۱۰). علاوه بر این، روغن دانه آن منبعی غنی از لینولئیک و اولئیک اسید است به طوریکه بیش از ۹۰ درصد اسید­های چرب آن را تشکیل می­ دهند (یانگ^[۱۰۷] و همکاران، ۲۰۱۱). میوه ویبورنوم اپولوس دارای مزه خاصی است که از نظر برخی مصرف­ کنندگان نامطلوب است. ترکیبات فرار و معطره این گیاه توسط SPME–GC–MS مورد آنالیز قرار گرفته و حضور دی و تری متیل-بوتانوئیک اسید، لینالول و اتیل­دکانوئات به عنوان عوامل ایجاد کننده بوی آن مورد تأیید قرار گرفتند (کراجالت^[۱۰۸] و همکاران، ۲۰۱۲).
نتایج مقایسه­ ای که میان قدرت آنتی­اکسیدانی عصاره حاصل از میوه­ گونه­ های V. opulus واریته­های sargenti، Americanum، Shukshinskaya، Krasnaya Grozd، Kiyevskaya Sadovaya و P3 صورت گرفت حاکی از آن بود که واریته sargenti بالاترین پتانسیل آنتی­اکسیدانی را داراست (کراجالت و همکاران، ۲۰۱۳).
عصاره خام استخراج شده از میوه­های گیاه Viburnum dilatatum Thunb که در ژاپنی gamazumi نامیده می­ شود و در زبان انگلیسی با نام درخت گلوله برفی شناخته می­ شود، می­توانند از آسیب­های اکسیداتیو در موش صحرایی پیشگیری کنند. این عصاره در هر گرم حاوی ۵۳ میلی­گرم ترکیبات پلی­فنولی می­باشد. این ترکیبات پلی­فنولی با بهره گرفتن از NMR، کروماتوگرافی مایع و طیف­سنجی جرمی شناسایی شدند که از مهمترین آن­ها می­توان به cyanidin 3-sambubioside(Cy-3- sam) و cyanidin 3-glucoside (Cy-3-glc) اشاره نمود (کیم^[۱۰۹] و همکاران، ۲۰۰۵). همچنین اثر آن بر آنزیم­ های آنتی­اکسیدانی در پلاسما، کبد و معده مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان می­ دهند مصرف این عصاره می ­تواند باعث کاهش نیاز به مصرف آنزیم­ های آنتی­اکسیدانی چون سوپراکسید ­دسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز گردد (آی­وای^[۱۱۰] و همکاران، ۲۰۰۳).
فصل سوم
مواد و روش ها
فصل سوم
مواد و روش ها
در این فصل به مواد مورد نیاز و روش­های آزمون پرداخته خواهد شد. در ابتدا گیاه مورد آزمون را آماده نموده و در شرایط تعریف شده (سه متغییر زمان، دما، نسبت آب به ماده خام) استخراج پلی­ساکارید صورت گرفت. پس از اندازه ­گیری راندمان و تعیین شرایط بهینه استخراج پلی­ساکارید، آزمون­های میکروبی و شیمیایی و تعیین خصوصیات ساختاری پلی­ساکارید، به نحوی که در ادامه تشریح خواهد شد، به انجام رسید.
۳-۱ زمان و محل اجرای آزمایش
این آزمایشات در سال تحصیلی ۹۴-۱۳۹۳ در آزمایشگاه شیمی و میکروبیولوژی گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین و دانشگاه تبریز انجام داده شد.
۳-۲ روش آماری اجرای آزمایش
۳-۲-۱ اعتبار سنجی مدل^[۱۱۱]
به منظور بهینه­سازی شرایط استخراج پلی­ساکارید برگ گیاه هفت­کول با سه متغییر دما، زمان و نسبت آب به ماده خام از نرم افزار دیزاین­اکسپرت^[۱۱۲] و روش سطح پاسخ (RSM^[113]) استفاده شد. پس از پیش ­بینی نقاط بهینه استخراج پلی­ساکارید توسط نرم­افزار و ارائه رابطه ریاضی با شرایط معنی­دار، این متغیرها با سطوح تئوری پیشنهادی، در آزمایشگاه، به صورت عملی بررسی شدند و درجه تطابق بین راندمان تئوری و عملی مورد مطالعه قرار گرفته و به تأیید رسید.
در این پژوهش برای برآورد تأثیر متغیر­های مستقل (X₁ : دما بر حسب درجه سانتی ­گراد؛ X₂ : زمان بر حسب دقیقه؛ X₃ : نسبت آب به ماده خشک بر حسب میلی­لیتر بر گرم ) بر متغییر وابسته (راندمان استخراج پلی­ساکارید) از روش سطح پاسخ استفاده شده و طرح Box-Behnken برای طراحی داده ­های آزمایشی به کار برده شد.
معنی دار بودن هر یک از جملات در معادله رگرسیونی مورد بررسی قرار گرفت و عبارات معنی­دار در مدل، توسط آنالیز واریانس (ANOVA) برای هر پاسخ مشخص شد. کفایت مدل بررسی شد و در نهایت برای مشخص کردن کارایی این روش، نقطه بهینه به دست آمده، در شرایط آزمایشگاهی انجام شده و با نتیجه پیش ­بینی شده توسط مدل، مورد مقایسه قرار گرفت.
۳-۲-۲ آنالیز آماری
تجزیه و تحلیل داده ­های مرحله دوم (بررسی اثر سطوح متفاوت غلظت پلی­ساکارید برگ گیاه هفت­کول در آزمون­های ضد­میکروبی و ضد­اکسایشی) در قالب طرح کاملا تصادفی و با بهره گرفتن از نرم­افزار آماری SPSS نسخه ۲۰ در سه تکرار انجام شد. مقایسه میانگین داده ­ها و بررسی معنی­دار بودن اختلاف بین آن­ها، توسط آزمون دانکن در سطح اطمینان ۹۵% انجام گرفت.
۳-۳ مواد، دستگاه­ها و ظروف مورد نیاز
برای انجام آزمون­های شیمیایی، میکروبی، تعیین ساختار و بررسی خواص حرارتی پلی­ساکارید حاصل، مواد و دستگاه­های زیر مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۳-۱ مواد
برگ گیاه هفت­کول جمع آوری شده از آذربایجان، الکل اتانول ۹۶ % (خریداری شده از شرکت نصر)، کاغذ صافی (واتمن) ۴۰، DPPH ( خریداری شده از شرکت سیگما)، متانول، BHT، فنانترولین، اسکوربیک اسید، بافر فسفات، فروس­سولفات و پراکسید­هیدروژن (خریداری شده از شرکت مرک) ، محیط کشت­های مولرهینتون آگار ، BHI ، YGC، سابورات دکستروز براث ، سابورات دکستروز آگار ( خریداری شده از شرکت مرک) ، محلول ۵/۰ مک­فارلند، دیسک استریل، ، سرم فیزیولوژی، سوش­های باکتریایی اشرشیا­کلی، سالمونلا تایفی ، انتروکوکوس فکالیس، مخمر کاندیدا آلبیکانس و کپک آسپرژیلوس فومیگاتوس.
۳-۳-۲ دستگاه­ها
آسیاب برقی (Moulinex)، ترازوی دیجیتال (مدل A&D ساخت ژاپن)، بن­ماری (مدل WNB10 ساخت آلمان (Memmert company))، سانتریفیوژ (GMBH مدل (Z206A) ساخت آلمان (Hermle labortechnik GMBA))، آون (مدل Heraeus ساخت کشور آلمان و Elektro Helios مدل (۱۲-۲۸۵) ساخت کشور سوئد)، سمپلر، اسپکتروفتومتر (wpa مدل (Biowaveii) ساخت انگلستان (Cambridge CB4 of J England))، کروماتوگرافی گازی (Shimadzu GC-14C ساخت ژاپن مجهز به ستونRtx 1701 ((30 m × ۰.۳۲ mm × ۰.۲ μm)، طیف سنج تبدیل فوریه (مدل Nicolet 6700 ،Thermo Company ساخت آمریکا، اتوکلاو (ابزار پزشکی کاووش ساخت ایران)، اینکوباتور (پارس آزما مدل L55 ساخت ایران جهت تأمین دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد و اینکوباتور(Kendvo مدل (T6) ساخت کشور آلمان جهت تأمین دمای ۲۸ درجه سانتی ­گراد))، ورتکس (مدل VELP ساخت ایتالیا).
۳-۳-۳ ظروف
بشر، قیف، استوانه مدرج، فالکون ۵۰ میلی­لیتری، پلیت، لوله آزمایش، پنس، سواب، پیپت، چراغ الکلی، سر سمپلر
۳-۴ استخراج پلی­ساکارید
برگ گیاه هفت­کول در تابستان ۱۳۹۳ از ارتفاعات ارسباران در آذربایجان جمع آوری و در آون ۱۱۰ درجه سانتی ­گراد خشک گردیده و به وسیله آسیاب برقی به صورت پودر در­آمد و الک گردید. استخراج پلی­ساکارید بر اساس روش ژائو^[۱۱۴] و همکاران (۲۰۱۳) با اعمال پاره­ای تغییرات انجام شد. به این صورت که پودر حاصل، تحت دمای استخراج ۵۰، ۷۰ و ۹۰ درجه سانتی ­گراد، نسبت آب به ماده اولیه۲۰، ۳۵ و ۵۰ میلی­لیتر بر گرم و زمان استخراج ۲۰، ۴۵ و۷۰ دقیقه قرار گرفت. سوسپانسیون حاصل بوسیله کاغذ صافی واتمن ۴۰ فیلتر شده و در استوانه مدرج جمع آوری شد. سپس ۳ حجم الکل اتانول ۹۶ % ، به آن افزوده و به مدت یک شب در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد نگهداری شد. لخته حاصل بوسیله سانتریفیوژ در ۷۰۰۰ دور در دقیقه به مدت زمان ۱۰ دقیقه جداسازی شد. لخته ته نشین شده پس از انتقال به آون ۵۰ درجه سانتی ­گراد و خشک شدن، با ترازوی با دقت ۰۰۰۱/۰ توزین گریده و جمع آوری شد.
۳-۴-۱ تعیین درصد راندمان بهینه استخراج پلی­ساکارید گیاه هفت­کول