واکسن سویه ی Rev.۱ نیز پس از کشف اولیه ی آن به وسیله ی البرگ در ۱۹۵۵ به طور وسیع در گوسفند و بز مورد استفاده قرار گرفته است. این واکسن نیز از دهه ی ۱۳۴۰ به بعد در بره و بزغاله، و طی سال های اخیر در گوسفند و بز بالغ درایران مصرف گردیده است.
سویه ی ۱۹ بروسلا آبورتوس درحال طبیعی به شکل صاف (Smooth) بوده و از نظر ساختار آنتی ژنی در لیپوپلی ساکارید آن هوموپلیمر پروزامین به صورت جزء زنجیره O وجود دارد. پروزامین زنجیره O آنتی ژن غالب بوده و بخش اصلی پاسخ آنتی بادی در مقابل این آنتی ژن اتفاق می افتد. از این رو، آنتی بادی های آگلوتینین کننده در آزمایش های سرولوژی استاندارد بروسلوز تقریباً به طور انحصاری برای پروزامین زنجیره O لیپوپلی ساکارید سویه های اسموس اختصاصی می باشند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

تردیدی نیست که این پاسخ ایمنی در مقابل زنجیره O مشکلاتی را در تشخیص سرولوژی بروسلوز موجب خواهد شد. بخشی از گاوهای واکسینه با واکسن زنده S.۱۹ تیترهای آنتی بادی راحفظ نموده و تمایز آشکار عفونت طبیعی را از تیتر واکسن در بررسی سرولوژی مانع می گردند.
در ساختار آنتی ژنی لیپو پلی ساکارید سویه های خشن (Rough) بروسلا زنجیره O و بالطبع پروزآمین وجود نداشته یا مقادیر بسیار جزئی وجود دارد. از این رو، استفاده از واریانت راف بروسلا آبورتوس با فقدان کامل زنجیره ی پروزامین و قابلیت تولید ایمنی مناسب، ضمن عدم تولید آنتی بادی مداخله کننده در تشخیص سرولوژی طی سال ها مورد توجه پژوهندگان بوده است.
سویه ی ۲۰/۴۵ بروسلا آبورتوس به عنوان سویه ی راف به بهترین وجهی مورد ارزیابی قرارگرفته و از واکسن زنده و کشته تولید شده ی این سویه استفاده شده است.اما این سویه در شکل زنده قابلیت برگشت پذیری به حالت اسموس داشته و واکسن سویه ی کشته به مکمل روغنی و ایمن سازی یادآور داشته و روی هم رفته نتایج بررسی ها در گاو کاملاً رضایت بخش نبوده است. علاوه بر آن، بررسی های آزمایشگاهی نشان داد که سویه ی ۲۰/۴۵ به طور کامل عاری از زنجیره ی پروزامین در لیپوپلی ساکارید نبوده است.
در سال ۱۹۸۲ سویه ی جهش یافته (موتانت) راف تحت نام RB۵۱ از سویه ی زهرآگین (حاد) ۲۳۰۸ اسموس بروسلا آبورتوس به وسیله ی دکتر گرهاردشوریگ از دانشگاه پلی تکنیک ویرجینیا تولید گردیده و پس از آن توسط پژوهندگان بسیاری مورد بررسی قرار گرفت. از کشت سویه ی ۲۳۰۸ بروسلا آبورتوس پس از ۳ پاساژ در محیط جامد حاوی غلظت های مختلف ریفامپین، پرگنه هایی با خصوصیات مورفولوژی راف ظاهر شده که رنگ کریستال ویوله را جذب نموده و با آکریفلاوین آگلوتینه شد. یکی از این پرگنه ها RB (بروسلا راف) نامگذاری شده و پاساژ های بیشتری روی محیط های حاوی غلظت های مختلف ریفامپین و پنی سیلین داده شد.
نتیجتاً دریک مرحله ی سویه یی با شماره RB۱۹ باعدم قابلیت جذب آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی پروزامین زنجیره O لیپوپلی ساکارید بروسلا آبورتوس به ظهور رسید. به منظور تعیین ثبات سویه ی جهش یافته، این سویه چندین بار روی محیط بدون آنتی بیوتیک پاساژ داده شده و در پاساژ نهایی مرتبه ی ۵۱ سویه ی RB ۵۱ به دست آمد. این سویه به ریفامپین و پنی سیلین مقاوم بوده و از نظر ساختار آنتی ژنی فاقد پروزامین در لیپوپلی ساکارید خود می باشد. از طرفی دیگر، پروتئین های دیواره ی سلولی سویه ی RB۵۱ مشابه سویه ی والد ۲۳۰۸ است.
این سویه طی ۹۳ مرتبه پاساژ در محیط آزمایشگاه خارج از بدن موجود زنده (in vitro) و ۱۵ پاساژ روی موش(in vivo) پایدار باقی مانده و هیچگونه تغییر ماهیتی از نظر برگشت پذیری نشان نداده است. بی ضرری و قابلیت ایمنی زایی این سویه در حیوانات مختلف آزمایشگاهی سنجیده شده و سرانجام به عنوان سویه ی واکسن زنده جهت گاو مورد استفاده قرار گرفت.
نظر به فقدان پروزامین درساختار آنتی ژنی سویه ی RB۵۱، هیچگونه آنتی بادی ناشی از واکسیناسیون در روش های متداول سرولوژی قابل شناسایی نبوده و بالطبع مشکلی در تشخیص سرمی به وجود نخواهد آورد. درآوریل سال ۱۹۹۶ مجوز تولید واکسن ازسویه یRB۵۱ جهت گاو به وسیله ی وزارت کشاورزی ایالات متحده ی آمریکا صادر شده و شرکت سرم سازی کلرادو مسئولیت تولید آن را به عهده گرفته است. از آن سال به بعد تدریجاً این واکسن جانشین واکسن S.۱۹ در بسیاری از کشورهای آمریکا شده است. این واکسن در ایران مورد ارزیابی وسیع قرار گرفته و در حال حاضر به دو شکل دوز کامل بامیزان جرم ۱۰۹x۳۴ ۱۰ در گوساله ها و دوز یک دهم آن در گاوهای بالغ مورد استفاده می باشد.
در انسان نیز از واکسن های کشته و زنده ی بروسلوز، و همچنین فراکسیونهای آنتی ژنی بروسلا ها استفاده شده است. Eyre در ۱۹۰۶ برای اولین بار از واکسن کشته ی بروسلا برای واکسیناسیون ۵۱ سرباز در جزیره ی مالت استفاده نمود. در ۱۹۲۳ Nicolle و Conseil از واکسن کشته در اثر حرارت و در ۱۹۵۸ Live از واکسن کشته با اتر استفاده نمودند. Braude و همکاران در سال ۱۹۴۹ واکسن کشته در اثر حرارت را به طریق خوراکی به کار گرفتند. تمامی این واکسن ها اثر محافظتی چند ماهه داشته اند.
در اتحاد جماهیر شوروی سابق واکسن زنده ی بروسلا از اوایل دهه ی ۱۹۵۰ مورد استفاده قرار گرفت. واکسن از بروسلا آبورتوس VA ۱۹ (واریته یی از بروسلا آبورتوس سویه ی ۱۹) تهیه شده و به میزان جرم یک میلیارد به طریق بین جلدی یا ۲۰۰ تا ۳۰۰ میلیون جرم به روش زیر جلدی تجویز می گردید. ایمنی حاصله یک ساله بوده و نیاز به تزریق مجدد داشت.
بین سال های ۱۹۵۲ تا ۱۹۵۸ سه میلیون نفر واکسینه شده و میزان بروسلوز انسانی نزدیک به ۶۰% کاهش یافت. در برخی مناطق آلوده میزان بیماری از ۱۰۰ مورد در صد هزار نفر درسال ۱۹۵۲ به میزان صفر در ۱۹۶۵رسید. با وجود این، تلقیح مکرر واکسن زنده واکنش های آلرژیک را موجب شده و واکسیناسیون مجدد به افرادی با واکنش های سرولوژی و آلرژیک منفی محدود گردید. سویه ی ۸۴ C بروسلا آبورتوس نیز به طور محدود در شوروی سابق استفاده شد.
در چین از سویه ی ۱۰۴ M بروسلا آبورتوس به روش بین جلدی، خوراکی و اسپری داخل بینی استفاده شده و تا حدی رضایت بخش بوده است. با وجود این، تزریق زیر جلدی واکسن مخاطره آمیز بوده وممکن است بروسلوز بالینی را موجب گردد. ظاهراً این واکسن به روش تلقیح خراش پوستی (بین جلدی) در نواحی روستایی هنوز استفاده می شود.
اولیتزکی در سال ۱۹۶۰ از سویه ی ۱۹ D بروسلا آبورتوس (موتانت سویه ی ۱۹ بروسلا آبورتوس) واکسن تهیه نموده و در اسرائیل به طور محدود مورد استفاده قرار داد. همچنین اسپینک از هر دو سویه ی ۱۹ بروسلا آبورتوس و Rev.۱ بروسلاملی تنسیس برای واکسیناسیون انسان درآمریکا به شکل محدود استفاده نمود.
تعدادی از فراکسیون های آنتی ژنی نیز جهت واکسیناسیون انسان مورد استفاده قرارگرفته اند. مهمترین این واکسن ها بهPI (Phenol Insoluble Fraction) معروف بوده که ابتدا از بروسلا ملی تنسیس سویه ی M۱۵ و بعد از بروسلا آبورتوس S.۱۹ تهیه می شود. هر دو عصاره از خواص بیولوژیک مشابهی برخوردار بوده و حاوی پروتئین ها، قندها و قندهای آمینی (عمدتاً هگزوآمین ها)، پپتید وگلیکان، لپیپد و مقادیر اندکی اسید نوکلئیک می باشد. در حال حاضر این واکسن به شکل تجاری موجود بوده و برای گروه های شغلی تجویز می گردد. واکسیناسیون هر دو سال یک بار و در صورت واکنش آلرژیک پوستی منفی تزریق می شود. واکسیناسیون با دو تزریق یک میلی گرمی PI به فاصله ی دو هفته انجام می پذیرد. اثر محافظتی واکسن پس از ۳۰ روز به حداکثر می رسد(هفته نامه پزشکی امروز).
۲-۹-۱٫ واکسن های کونژوگه و طراحی آن ها:
افزایش ایمونوژنیسیته ی پلی ساکارید ها اولین بار در سال ۱۹۳۱ توسط آوری وگوبل کشف شد. پیوند کووالانسی بین پلی ساکارید و پروتئین حامل مناسب منجر به تشکیل شدن کونژوگه می شود. طراحی واکسن های کونژوگه، ۲ بخش اساسی را در بر دارد: انتخاب ترکیبات مناسب، پروتئین و پلی ساکارید، و انتخاب یک روش صحیح و مناسب در متصل کردن این دو ترکیب اصلی از طریق یک باند کووالان شیمی می باشد. برای تشکیل این پیوندهای شیمیایی بین پلی ساکارید و پروتئین به ماهیت گروه های عملکردی در دسترس موجود بر روی هر ترکیب و پایداری گروه های حساس عملکردی موجود بر روی پلی ساکارید یا پروتئین، تحت شرایط واکنش کونژوگاسیون بستگی دارد.در مقایسه با ایمونوژنیسیته ضعیف و محدود پلی ساکاریدها،کونژوگه های پروتئین –پلی ساکارید، تیترهای بالای آنتی بادی های اختصاصی پلی ساکارید را القاء می کنند، همچنین پاسخ آنتی بادی القاءشده ،پس ازدوزهای یادآور،افزایش قابل ملاحظه ای دارد. مثلا واکسن های کونژوگه آنفولانزا، قادر هستند تیتر بالایی از آنتی بادیهای اختصاصی پلی ساکارید را در نوزادان القاء کنند و آنها را از عفونت ناشی از هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b محافظت نمایند(۳، ۴، ،۲۷،۷).
۲-۹-۱-۱٫ انتخاب پلی ساکارید
پلی ساکاریدهای باکتریایی، اگر به شکل اصلی خود جدا گردند، در محدوده هایی از اندازه های مولکولی وجود دارند، و برخلاف پروتئین ها، حتی پلی ساکاریدهای جدا شده از یک کشت باکتری، پراکندگی وزن مولکولی متفاوتی را نشان می دهند. با توجه به مطالعات، چنین به نظر می رسد که اندازه اپتیمم ساکارید، به ماهیت پلی ساکارید بستگی دارد و برای هر پلی ساکارید باید به شکل جدا مشخص گردد.تحقیقات گسترده نشان داده است که مولکول پلی ساکاریدی که برای کونژوگه استفاده می‏شود اگر خیلی کوتاه ویا خیلی بلند انتخاب شود معمولاً غیر ایمونوژن شده و قادر به تحریک سیستم ایمنی نخواهند بود. بنابراین انتخاب طول زنجیره مولکول پلی ساکارید برای کونژوگاسیون بسیار مهم بوده و باید با وسواس انتخاب گردد. اغلب توصیه می‏شود که مولکول هاپتن دارای حداقل بیش ازدو بار واحد تکراری پلی ساکارید باشد و نیز مولکول‏های خیلی سنگین نیز به خوبی سیستم ایمنی را تحریک نمی‏کنند(۳، ۴، ۷، ۴۱).
۲-۹-۱-۲٫ انتخاب پروتئین حامل:
برای اینکه یک پروتئین، به عنوان یک حامل قابل قبول در واکسن های کونژوگه مورد استفاده قرار گیرد، باید غیرتوکسیک بوده و اپی توپ های مناسبی برای برهمکنش با سلول های T داشته باشد. این معیارها، تعداد بیشماری از پروتئین ها را کاندید میکند، در حالی که در عمل، تنها گروهی از پروتئین های باکتریایی را می توان در واکسن های کونژوگه به کاربرد.
۲-۹-۱-۳٫ نسبت پلی ساکارید به پروتئین:
فضا و چگالی پلی ساکارید بر پروتئین اثرات عمده ای بر توانایی کونژوگه برای القا پاسخ ایمنی دارد.اندازه گیری نسبت جفت شدگی آنتی ژن پلی ساکارید به پروتئین حامل بعضی از اطلاعات را درباره ی ساختار کونژوگه فراهم می کند و ضروری است که همه ی مواد آزاد ( جفت نشده ) از مخلوط نهایی واکنش حذف گردند. این عمل می تواند با اولترا فیلتراسیون ،کروماتوگرافی مایع، الکتروفورز یا ته نشینی افتراقی به دست آید(۷،۲۷، ۴۸)
۲-۹-۱-۴٫ تهیه ی کونژوگه های ایمونوژن هاپتن–حامل:
ماهیت ایمنی تطبیقی به توانایی یک موجود زنده در واکنش به مواد بیگانه و تولید آنتی بادی و واکنش متقابل آنها و حفاظت از میزبان می باشد.یک آنتی ژن یا ایمونوژن ماده ای است که، توانایی تولید این نوع پاسخ ایمنی را دارد و قادر به واکنش با سلول های تحریک شده و آنتی بادی هایی تولید شده علیه آن ها است.سیستم ایمنی دو نوع پاسخ علیه چالش های ایجاد شده توسط مواد بیگانه را دارد : پاسخ ایمنی سلولی،که توسط لنفوسیت هایTایجاد می شود و پاسخ ایمنی همورال،که توسط لنفوسیت هایBتولید می گردد . نوعی از لنفوسیت های B که پروتئین های ترشحی به نام آنتی بادی تولید می کنند پلاسماسل نام دارند.کونژوگاسیون پلی ساکارید با پروتئین، پلی ساکارید را از فرم آنتی ژن غیروابسته به سلولT به آنتی ژن وابسته به سلول T تبدیل می کند، که سبب القاء تیترهای بالای پاسخ ایمنی در حیوانات می شود. آنتی ژن ها معمولا ماکرومولکول هایی هستند که شامل مکان های آنتی ژنی تشخیصی یا اپی توپ ها ی سازمان دهی شده می باشند که با اجزاء سیستم ایمنی واکنش متقابل دارند. آنتی ژن ها ممکن است مولکول هایی با ترکیبات آلی مانند : پروتئین، لیپوپروتئین،RNA ، DNA، پلی ساکارید ها و یا قسمت هایی از ساختارهای سلولی باکتریایی ،قارچ یا ویروس باشند.مولکول های کوچکی مانند پپتید های کوتاه که اغلب نمی توانند به تنهایی باعث ایجاد پاسخ ایمنی گردند را هاپتن گویند. این مولکول ها آنتی ژن های ناقصی هستند که به صورت ترکیب با مولکول حامل مناسب می تواند به عنوان ایمونوژن عمل کند. حامل ها معمولا مولکول هایی با وزن مولکولی بالا هستند. مولکول های هاپتن حاوی آلدهید با مولکول حامل توسط احیای آمیناسیون متصل می گردند(۴۳،۴۴، ۴۶).
۲-۹-۱-۵٫ پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیکی:
متداول ترین حامل های مورد استفاده مولکول های بزرگی هستند که ایمنی زایی بالایی ایجاد می کنند و با مولکول هاپتن پیوند کووالانسی برقرار می کنند. یکی از مناسب ترین آن ها پروتئین ها می باشند اما حامل های دیگری مانند لیپید دو لایه ( لیپوزوم )، پلیمرهای طبیعی یا مصنوعی ( دکستران ، آگارز ، پلی–L- لیزین ) یا مولکول های طراحی شده نیز وجود دارند.اولین مولکول های حامل برای کونژوگاسیون ،پروتئین های ایمونوژن بودند.حامل های پروتئینی به فراوانی حل می شوند و داری گروه های عاملی بسیاری هستند که می توانند کونژوگاسیون با مولکول هاپتن را تسهیل کنند.متداول ترین حامل های پروتئینی که امروزه از آن ها استفاده می گردد به شرح زیر می باشند :
KLH سرم آلبومین گاوی( BSA)، سرم آلبومین گاوی آمینواتیل دار ( یا کاتیونیزه( cBSA ، تیروگلوبولین، اوآلبومین(OVA) و انواع توکسوئید های پروتئینی مانند توکسین ها یا توکسوئید دیفتری، توکسین یا توکسوئید کزاز، موتانت های غیر توکسیک دیفتریCRM -197 ، اگزوتوکسینA سودوموناس، پنومو لیزین استرپتوکوکوس پنومونیه، فیلامنت هماگلوتینین(FHA) بوردتلا پرتوزیس، پیلی یا پیلین نایسریا گونوره آ، پیلی یا پیلین نایسریا مننژیتیدیس،OMP باکتریایی مثل کمپلکس OMP نایسریا مننژیتیدیس مثل ( پروتئین کلاس ۱ و کلاس ۳ غشای خارجی ) ، OMP نایسریا گونوره آ، پپتیدازC5A استرپتوکوکوس و پروتئین های سطحی موراکسلا کاتارالیس. دیگر پروتئین هایی که گاهی اوقات استفاده می شوند : میوگلوبین ، سرم آلبومین خرگوش،مولکول های ایمونوگلوبین ( به ویژهIgG )از سرم موشی یا گاوی، توبرکولین خالص شده و پلی پپتید های سنتزی مثل پلی–ال - لیزین و پلی–ال–گلوتامیک اسید می باشد. هر چند از توکسین های سم زدایی شده ی باکتریایی استفاده می شود با این حال داری اشکالاتی نیز می باشند زیرا مراحل سم زدایی شیمیایی تغییرات منطقه به منطقه ایجاد می کند. بنابراین، تغییر ویژگی های فیزیکی و شیمیایی توکسین می تواند بر بازده کونژوگاسیون تأثیر گذار باشد.کونژوگاسیون این پروتئین ها با مقادیر زیادی از ساکارید ممکن است تأثیری روی ویژگی های ساختاری و غیر فعال کردن اپی توپ های سلولB/Tداشته باشدو این موضوع به مقدار ساکارید جفت شده به پروتئین بستگی دارد. پروتئین های حامل تهیه شده مثلCRM197آنالوگ غیر توکسیک توکسوئید دیفتری است( ۲۷،۲۹،۴۷) .
۲-۹-۱-۶٫ ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه:
آلومینیوم فسفات ،آلومینیوم هیدروکساید، مونوفسفوریل لیپیدA،۳– دی آسیل مونوفسفوریل لیپیدA،۲۱QS ،همچنین انواع پاک کننده ها ( دتر جنت ) : ( تریتون۱۰۰x، زوئیتر جنت و دزوکسی کولات ) در ترکیب با ترکیبات آلومینیومی . در کل، پاسخ آنتی بادی ها در حضور کونژوگه ی همراه ادجوانت در واکسن،افزایش مییابد.
۲-۹-۱-۷٫ جفت شدگی شیمیایی ( اتصال) :
پلی ساکارید به هنگام اتصال به پروتئین حامل پیوند کووالان تشکیل می دهد.روش های زیادی برای کونژوگه کردن مولکول های آلی زیستی شامل ساکاریدها و پروتئین ها وجود دارد.اغلب این تکنیک ها وابسته به کروماتوگرافی هستند و در تحقیقات اولیه ی تهیه ی واکسن استفاده می شوند.این روش ها شامل واکنش هایی از قبیل : احیای آمیناسیون،آمیداسیون و اتریفیکاسیون هستند.همچنین شکلی از جفت شدگی ( کوپلینگ ) مانند دی سولفید،تیوکربامویل ، O - آلکالیزو اوره یا دیازو نیز وجود دارد.
کونژوگاسیونی که توسط احیای آمیناسیون ،آمیداسیون،شکلی از یک پیوند تیواتریا ترکیبی از این قبیل را حاصل می شوند استحکام زیادی را نشان می دهند.به خاطر بعضی از ترکیبات ساکاریدی شرایط کوپلینگ باید آهسته و ملایم انجام گردد.براین اساس، پارامتر های واکنش مانندpH،دما،زمان واکنش و محلول های شیمیایی باید به دقت تنظیم شوند.هنگام کونژوگه کردن الیگوساکاریدها،اغلب ازSpacer( فضا دهنده ) استفاده می گردد مانند : آدپیک اسید دی هیدرازید( ADH )، دی آمینو بوتان یا۶–آمینو هگزانوئیک اسید.یک فضا دهنده می تواند با جلوگیری از احیای استری قسمت های فعال شده بازده کوپلینگ با پلی ساکارید ها را بالا ببرد.در واقع، فضا دهنده می تواند یک ساختار جدید آنتی ژنی ایجاد کند که امکان دارد بی ضرر یا سمی باشد یا منجر به تولید غیر ضروری مقادیر زیادی از آنتی بادی های غیر حفاظتی برای ایمنی زایی با کونژوگه گردد ( ۱۴، ۲۷، ۴۵، ۴۶).
۲-۹-۱-۸٫ EDC یا EDAC :
محبوب ترین و متداول ترین کربو دی ایمید برای استفاده در کونژوگه ی مواد بیولوژیکیEDAC می باشد.به صورت محلول در آب و بدون استفاده از حلال های آلی قابل استفاده است.محلول های اضافی و ایزواوره های تشکیل شده مانند فراورده های واکنشی اتصال متقاطع که هر دو محلول در آب می باشند باید توسط دیالیز و ژل فیلتراسیون حذف شوند.این ماده به دلیل ناپایداری در برابر آب،باید در مکانی خشک و دمای ℃۲۰–نگهداری گردد و قبل از استفاده از آن باید در دمای اتاق گرم شود .در محلول های آبی هیدرولیز توسط آب صورت می گیرد که واکنش رقابتی اصلی می باشد. جدا شدن واسطه ی استری فعال، تشکیل ایزو اوره می دهد و کربوکسیل احیا می شود .هیدرولیز استر فعال درpH=4/7با کربودی ایمید EDAC محلول در آب انجام می گردد.
۲-۹-۱-۹٫ آدپیک اسید دی هیدرازید ( Adipic Acid Dihydrazide ) :
محلول دی هیدرازید مشتق شده از آدپیک اسید،محبوب ترین و پرکاربرد ترین محلول هوموبی فانکشنال می باشد.آدپیک اسید دی هیدرازید ماده ای جامد است که قابل حل شدن در محلول های آبی می باشد.اما ممکن است نیاز به کمی گرما برای ایجاد محلول غلیظ باشد.ماده های حاوی آلدهید با این محلول پیوند هیدرازون تشکیل می دهند(۱۴، ۲۷، ۴۲).
۲-۹-۱-۱۰٫ کونژوگاسیون به شیوه آمیداسیون:
بسیاری از پلی ساکارید‏های باکتریایی در حالت طبیعی فاقد گروه‏های شیمیایی فعال مانند گروه‏های آمینوو یا کربوکسیل هستند، به همین دلیل به طور مستقیم نمی‏توانند به یک حامل پروتئینی با پیوند کووالان متصل شوند. در کونژوگاسیون به روش آمیداسیون که از بهترین روش‏های موجود برای کونژوگه کردن ترکیبات پلی ساکاریدی به پروتئین می‏باشد از آدپیک اسید دی هیدرازید به عنوان یک مولکول فاصله ‏گذارو EDAC در نقش عامل اتصال دهنده استفاده می‏شود. سیانوژن بروماید ابتدا سبب ایجاد گروه‏های آمینی در مولکول پلی ساکارید شده و در مرحله بعد ADH که یک مولکول نوکلئوفیل می‏باشدبه صورت کووالان به گروه‏های آمینی مولکول پلی ساکارید متصل می‏شود. EDACنیز در مرحله سوم سبب اتصال کووالان مشتق آدپیک هیدرازید-پلی ساکارید به حامل پروتئینی به صورت پیوند آمیدی بین هیدرازید پلی ساکارید با گروه‏های کربوکسیل پروتئین می‏شود.ممکن است واکنش‏های جانبی دیگری بین گروه‏های آمین اسید آمینه لیزین و کربوکسیل مجاور در یک مولکول پروتئینی و یا در سایر مولکول‏های پروتئینی به صورت اتصال متقاطع درون مولکولی یا خارج مولکولی صورت پذیرد. کونژوگاسیون با روش آمیداسیون سبب می‏شود در چندین محل، پلی ساکارید به مولکول حامل متصل شده و ساختار مشبکی ایجاد کند واین حالت را ساختار مشبک(Lattice structure) می‏گویند. بررسی‏های محققان نشان داده که در روش آمیداسیون اگر عامل توکسوئید دیفتری به جای توکسوئید کزاز استفاده شود، میزان ایمونوژنیسیته واکسن کاهش پیدا می‏کند. از لحاظ پایداری نیز این روش یکی از پایدار‏ترین نوع مولکول‏های کونژوگه را ایجاد می‏کند. به طوریکه کونژوگه‏های پلی ساکاریدی با توکسوئید کزاز تهیه شده با این روش در حرارت۵۵ درجه سانتی‏گراد تا بیش از۵ هفته ایمنی زایی خود را حفظ می‏کنند( ۳، ۴، ۲۷، ۳۷، ۴۷، ۴۸).
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱٫ تهیه میکروارگانیسم مورد نظر:
باکتری های استاندارد بروسلا آبورتوس سویه RB51 جهت تهیه Omp و بروسلا آبررتوس سویه S99 جهت تهیه LPS از مرکز کلکسیون باکتری های استاندارد انستیتو پاستور ایران تهیه گردید.
۳-۲٫ باز کردن سوش لیوفریزه بروسلا آبورتوس
مواد و وسایل: آمپول لیوفیلیزه سوش S99 و RB51،بوآت ،انکوباتور ۳۷ درجه، PBS(بافرفسفات نمکی) با PH= 6.4، لوله های تهیه بذر، سرنگ ۵ سی سی، محیط بروسلا براث و آگار (مرک).