۳۰۰۰bp
L
۲
۱
شکل۱۰-۳- هضم آنزیمی ناقل‏های استخراج شده از کلونی­های حاصل از واکنش اتصال وکتور pGEM و hrpw و همچنین hrpG و pUC19
L: مارکر Kb1، ۱: pUC19-hrpG، ۲: pGEM-hrpW
تایید همسانه­سازی ژن­های hrpW/G در ناقل­های کلونینگ با روش واکنش زنجیره­ای پلیمراز
برای اطمینان بیشتر با بهره گرفتن از ناقل‏های مورد تایید مرحله­ قبل بعنوان الگو، واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی طراحی شده صورت گرفت که نتایج حاصل تاکیدی موکد بر صحیح بودن و انجام همسانه‏سازی ژن­های موردنظر در ناقلین مربوطه بود.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

با توجه به شکل زیر و عدم وجود باند در نمونه­ پلاسمید فاقد ژن خارجی در واکنش و حضور باندهای ۹۱۲ و ۷۹۲ جفت بازی در استفاده از پلاسمیدهای نوترکیب بعنوان الگو، مبین موضوع مذکور می­باشد.
۷۹۲bp
۹۱۲bp
L
۱
۲

۳

۱
شکل۱۱-۳- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز پلاسمیدهای تایید شده بر روی ژل آگارز ۱%
L: مارکر Kb1، ۱: hrpw، ۲: وکتور غیر نوترکیب، ۳: hrpG
همسانه­سازی ژن­های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121
وکتور بیانی pBI121 دارای استفاده گسترده­ای برای تراریزش گیاهان است. طول این پلاسمید ۱۴۷۵۰ جفت باز می­باشد. ناحیه T-DNA (6193 جفت باز) این وکتور از بخش­هایی متشکل از مرز راست، نشانگر انتخابی برای تشخیص گیاهان تراریخته از غیر تراریخته، مشتمل بر پیشبر NOS، ژن nptII ، ترمیناتور NOS و ژن گزارشگر بتاگلوکورونیداز مشتمل بر، پش‏برد CaMV355، ژن gus و ترمیناتور NOS و مرز چپ می‏باشد. با این تفاسیر این وکتور بعنوان ناقل ایده­آل و در راستای هدف ما جهت انتقال ژن‏های هدف به گیاه میزبان تحت پیشبر و ترمیناتور مناسب انتخاب شد. در این پژوهش ژن hrpW می­بایست جایگزین ژن gus در پلاسمید pBI121 می­شد، بطوریکه پیشبر۳۵S و ترمیناتور NOS را دریافت کند و همچنین ژن hrpG نیز به گونه ­ای می­بایست وارد شود که ژن gus نیز در یک قالب با ژن مذکور قرار می­گرفت، که بدین منظور با حذف کدون خاتمه در انتهای َ۵ آغازگر برگشتی تعریف شده برای hrpG این امر محقق شد.
با توجه به وجود دو سازه که یکی بدون gus و دیگری با حفط ژن gus همراه می­باشد و همچنین نیاز به حفظ پشبر و ترمیناتور (Nos, 35S) مربوطه و در راستای مطالعات قبلی مربوط به توالی­های نوکلئوتیدی ژن­های hrpG , hrpW جایگاههای SacI , XbaI به منظور همسانه‏ سازی ژن hrpw و جایگاهها BamHI , XbaIبه منظور همسانه‏سازی ژن hrpG گزینش گردید.
هدف از حفظ gus.intron در سازه­ی pBI.hrpG و حذف آن از سازه­ی دیگر مطالعه­ بیان پروکاریوتی در سلول میزبان گیاهی بود، با توجه به اینکه بیان ژن­های hrp تحت تاثیر شرایط محیطی آپویلاست در گیاه تنظیم می­ شود، انتظار می­رود که بیان پروکاریوتی ژن­های hrp در پاسخ به شرایط آپوپلاستی گیاه میزبان باکتری آگروباکتریوم نزدیک به صفر باشد، که این شیوه صحت یا عدم صحت این فرض را با آنالیزهای بیان از بافت گیاهی نشان می­دهد.
حال به منظور همسانه‏سازی ژن‏های hrpG و hrpW در pBI121، آنها را تحت تاثیر آنزیم‏های برشی تعیین شده برای هر کدام یعنی XbaI/SacI برایXbaI/BamHI , pBI/hrpW برای pBI/hrpG برش داده و پس از الکتروفورز بر ژل آگارز و متعاقباً بازیابی آن (شکل۱۴-۳) واکنش اتصال بین آنها با توجه به شرایط بهینه اتصال صورت پذیرفت. لازم به ذکر است که تعیین غلظت قطعه الحاقی و ناقل بر اساس (شکل ۱۵-۳) حاصل از الکتروفورز محصول بازیابی شده بر روی ژل آگارز تعیین شد.
۴
۵
L
۳
۱۳.۸kb
۶
L
۲
۱
۱.۸kb
الف
ب
شکل۱۲-۳- هضم آنزیمی ناقل بیانی جهت بازیابی از روی ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)
L: مارکر Kb1، ۱-۲: قطعات ریکاوری شده pBI121 (XbaI/BamHI) 3: قطعه‏ی ریکاوری شده pBI121 (XbaI/SacI)
۴-۵: قطعات برش خورده pBI121 (XbaI/BamHI) 6: برش خورده pBI121 (XbaI/SacI)
۷