فصل چهارم
۴- نتایج و بحث
۴-۱ آماده کردن سازه ژن WDREB2
به منظور ساخت سازه بیان ، از ناقل بیان گیاهیpBI121 استفاده شد که دارای ژن نشانگر انتخابی ایجاد کننده مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین (nptII) می باشد. ژن WDREB2 در این ناقل تحت کنترل پروموتر CaMV35S و ترمیناتور NOS بوده و جایگاه های شناسایی مربوط به آنزیم برشی BamHI در سمت ۵َ و آنزیم برشی SacI در سمت ۳َ ژن قرار دارند (شکل۴-۱).
WDREB2
CaMV 35S
promoter
NOS-p
NOS-T
NPT II (Kan^r)
شکل۴-۱ نقشه ناقل سازه WDREB pBI121-
۴-۲ تراریختی اگروباکتریوم
برای انتقال ژن WDREB2 به گیاهان گندم سازه pBI121-WDREB2 از باکتری E.coli استخراج شد. به علت این که سویه آگروباکتریوم یک عامل مهم در موفقیت انتقال ژن به گیاهان می باشد (Razzaq et al., 2010). سویه های اگروباکتریوم توموفسینس LBA4404 ، C58 و AGL0 با سازه استخراج شده تراریخت شد. در تراریختی اگروباکتریوم از روش ذوب و انجماد استفاده شد و پس از آن به منظور تائید تراریختی، از کلونی های نوترکیب باکتری اگروباکتریوم که در محیط LB دارای آنتی بیوتیک های کانامایسین و ریفامپیسین رشد کرده بودند، با بهره گرفتن از پرایمر های TaDREB واکنش PCR انجام شد (شکل ۴-۲).
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۵ ۴ ۳ ۲ ۱
شکل ۴-۲ نقوش الکتروفورزی محصول PCR کلونی های نوترکیب اگروباکتریوم دارای سازه pBI+WDREB2
راهک ۱- نشانگر وزنی ۱۰۰ جفت بازی، راهک ۲- کنترل منفی، راهک ۳ و ۴- باند ۱۲۵۷ جفت بازی حاصل از آغازگر TaDREB
۴-۳ تراریختی گیاهان گندم با واسطه اگروباکتریوم
امروزه بخوبی مشخص شده است که کارایی روش های انتقال ژن وابسته به چندین عامل است از جمله وجود یک روش باززایی قابل اطمینان، وجود فنون انتقال ژن مناسب با راندمان بالا و سرانجام روشی برای انتخاب بافت های تراریخت مورد نیاز می باشد. برای رسیدن به این ملزومات دانشمندان نه فقط روی روش های انتقال ژن بلکه روی بهینه سازی باززایی گندم در کشت بافت نیز تمرکز می کنند (Sahrawat et al., 2003). به دلیل این که پاسخ گندم به کشت بافت تحت تاثیر ژنوتیپ (Farooq et al., 2004; Dodig et al., 2006; Mitic et al., 2006)، منبع ریزنمونه، منشاء جغرافیایی، وضعیت فیزیولوژیکی گیاهی که ریز نمونه از آن تهیه می شود، محیط کشت و برهمکنش بین آنها قرار می گیرد (Ozgen et al., 1996) در مطالعات کشت بافت گندم چندین ریز نمونه از جمله جنین نابالغ (Keresa et al., 2003)، گل آذین نابالغ، جنین بالغ (Nacirsilar., 2006)، مزوکوتیل، بذر، مریستم انتهایی و برگ های جوان مورد استفاده قرار گرفته است. در این پژوهش نیز از ارقام حساس به تنش شیراز و الموت استفاده شد و جنین بالغ به علت اینکه از نظر فیزیولوژیکی کمترین تغییرپذیری را نشان می دهد و در تمام فصول سال در دسترس می باشد (Turhan and Baser, 2004) به عنوان ریزنمونه انتخاب شد. پس از ضد عفونی بذرها جنین ها جدا شد و روی محیط MS بدون هورمون کشت شدند (۴-۳)
شکل ۴-۳ جنین های جدا شده گندم روی محیط MS بدون هورمون
بعد از جنین گیری، ریز نمونه ها با سویه های ذکر شده آگروباکتریوم تلقیح شدند و بعد از ۳ روز نگهداری در محیط همکشتی با به محیط استراحت منتقل شدند (۴-۴).
شکل ۴-۴ نگهداری گیاهچه ها در محیط استراحت، قبل از بردن به محیط انتخابی
در مرحله بعد گیاهچه ها به محیط انتخابی منتقل شدند. در این پژوهش در مراحل مختلف نزدیک به ۲۰۰۰ جنین مورد استفاده قرار گرفت. در ابتدا کانامایسین عامل گزینشگر بود و مراحل بعد به علت عدم کارایی مناسب، جنتیسین (G418) جایگزین شد. این آنتی بیوتیک به خوبی باعث سفید شدن بافت غیر تراریخت شده و بافت های تراریخت سبز باقی ماندند(۴-۵).
شکل ۴-۵ سفید شدن گیاهچه در محیط انتخابی بر اثر عامل گزنشگر جنتیسین
بعد از مرحله انتخابی گیاهچه های باقی مانده به محیط باززایی و سپس به ریشه زایی منتقل شدند(۴-۶).
شکل ۴-۶ گیاهچه ها در مرحله باززایی
۴-۴ استخراج DNA گیاهان تراریخت
با بهره گرفتن از روش CTAB، استخراج DNA از ۴۰ گیاه بدست آمده از مرحله قبل انجام شد و پس از آن روی ژل آگارز ۱% الکتروفورز شد (۴-۷).
شکل ۴-۷ نقوش الکتروفورزی DNA استخراج شده برخی از گیاهان تراریخت
۴-۵ واکنش زنجیره ای پلیمراز برای تایید وجود ژن WDREB2 در گیاهان تراریخت
به منظور تایید حضور ژن WDREB2 در گیاه از واکنش زنجیره ای پلیمراز و آغازگرهای اختصاصی ژن TaWDREB استفاده شد. واکنش PCR از گیاهان تراریخت و غیر تراریخت گیاه گندم انجام که پلاسمیدpBI121 حاوی ژن WDREB به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. پس از اتمام واکنش ، محصول واکنش روی ژل آگارز ۱% الکتروفورز شد. وجود قطعه ۱۲۵۷ جفت بازی در گیاه گندم تراژن و عدم وجود آن در گیاه غیر تراریخت، تراریختی گیاهان گندم و حضور ژن WDREB2 در گیاهان بازیابی شده را تایید می کند. تعداد ۱۵ گیاه از ۴۰ گیاه بدست آمده تراریختی آن ها به اثبات رسید (۴-۸).
۱۵ ۱۴ ۱۳ ۱۲ ۱۱ ۱۰ ۹ ۸ ۷ ۶ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱
شکل ۴-۸ نقوش الکتروفورزی محصول PCR با پرایمر تخصصی ژن WDREB2
راهک ۱- نشانگر وزنی ۱۰۰ جفت بازی، راهک ۲- کنترل منفی، راهک ۱۰و ۱۱ باند ۱۲۵۷ جفت بازی حاصل از آغازگر TaDREB
۴-۶ استخراج RNA و ساخت cDNA
استخراج RNA از نمونه هایی که تراریخت بودن آنها با بهره گرفتن از واکنش زنجیره ای پلیمراز مثبت بود انجام شد. سپس جهت اطمینان از ساخت cDNA واکنش زنجیره ای پلیمراز با بهره گرفتن از پرایمر تخصصی ژن WDREB انجام شد که نشان داد ساخت cDNA همه نمونه ها به درستی انجام شده است (۴-۹).
۱۱ ۱۰ ۹ ۸ ۷ ۶
۵ ۴ ۳ ۲ ۱
۴-۹ نقوش الکتروفورزی PCR با پرایمرهای تخصصی ژن WDREB جهت اطمینان از صحت cDNA
راهک ۱- نشانگر وزنی ۱۰۰ جفت بازی، راهک ۲- کنترل منفی، راهک های ۳-۱۱ باند ۱۲۵۷ جفت بازی حاصل از آغازگر TaDREB
۴-۷ انجام Real Time PCR
نتایج بدست آمده از آزمون Real Time PCR نشان دهنده میزان بیان بالایی در بعضی از گیاهان تراریخت نسبت به گیاه شاهد غیر تراریخت می باشد (شکل های ۴-۱۰، ۴-۱۱، ۴-۱۲).
شکل ۴-۱۰ نمودار ذوب که نشانه تک باند بودن و تخصصی بودن پرایمر را نشان می دهد
شکل ۴-۱۱ آزمون Real Tim PCR ژن WDREB
شکل ۴-۱۲ الگوی بیان ژن در گیاهان ترایخت نسبت به گیاه غیرتراریخت