بر اساس معادله (۳-۳۴) نرخ تغییر CO در فاز مایع (که با  یا به صورت تغییرات فشار جزئی CO در فاز مایع  نشان داده می شود) برابر است با نرخ انتقال CO به فاز مایع منهای نرخ مصرف آن در فاز مایع در نتیجه تبدیل بیوکاتالیستی. از این رابطه می توان برای تعیین نرخ مصرف ویژه CO، q_CO،که در معادلات کینتیکی کاربرد دارد استفاده کرد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

فصل چهارم: نتایج آزمایشها و تحلیل داده ها
مقدمه
در این فصل به ارائه نتایج آزمایشها و بررسی و تحلیل یافته های آزمایشگاهی پرداخته می شود. نتایج مربوط به آزمایشهای ناپیوسته در غالب تاثیر سوبسترای آلی روی عملکرد محیط کشت، نقش همزمان عوامل کاهنده و pH در محیط کشت باکتری، تاثیر فشار گاز سنتز در محیط کشت ناپیوسته لانگالی و بررسی کینتیک آزمایش ناپیوسته ارائه می گردد. در ادامه، نتایج مربوط به آزمایشهای پیوسته تخمیر گاز سنتز در بیوراکتور ارائه شده و تاثیر نرخ رقیق سازی، شدت جریان گاز سنتز و دور همزن بیوراکتور روی عملکرد باکتری در فرایند تخمیر مورد بحث و بررسی قرار می گیرد و با بهره گرفتن از یافته های آزمایشگاهی ضرایب انتقال جرم و پارامترهای مربوط به بازده فرایند محاسبه می گردند.
تاثیر سوبسترای آلی
باکتری لانگالی می تواند انواع مختلفی از سوبستراها را به اتانول و استات تخمیر کند. این باکتری مسیر متابولیکی پیچیده ای از خود نشان می دهد که هر دو فاز استوژنیک (تولید اسید) و سالونتوژنیک (تولید حلال) را شامل می شود. به منظور بررسی تاثیر سوبستراهای آلی مختلف در تحریک مسیر متابولیکی باکتری به سمت فاز سالونتوژنیک، از چهار سوبسترای آلی فروکتوز، گلوکز، اتانول و استات در محیط کشت ناپیوسته باکتری لانگالی استفاده شد و نقش آنها در رشد سلول و تولید محصول مطالعه گردید.
رشد سلول و مصرف سوبسترا
رشد باکتری لانگالی در محیط کشت ناپیوسته با سوبستراهای فروکتوز، گلوکز، اتانول و استات بررسی گردید. در فرایند رشد هتروترفیک باکتری روی گلوکز و فروکتوز، سوبسترای آلی از طریق مسیر متابولیکی امدن- میرهوف- پاراناس^[۲۷۱] که به عنوان فرایند گلیکولایسیس^[۲۷۲] نیز شناخته می شود به پیروات تبدیل می شوند. سپس، تبدیل اکسایشی پیروات، استیل-کوآنزیم A تولید می کند که یک ترکیب واسطه و مهم در چرخه متابولیکی استوژنهاست. باکتری از استیل-کوآنزیم A تولید شده برای تولید سلول و انرژی از طریق فرایندهای آنابولیک^[۲۷۳] و کاتابولیک^[۲۷۴] استفاده می کند. در مسیر آنابولیک، مقدار کمی از استیل-کوآنزیم A به صورت کاهشی کربوکسیله می شود تا در حضور آنزیم پیروات: فردوکسین اکسیدورداکتاز^[۲۷۵] پیروات تولید کند. سپس پیروات تولید شده به فسفوانول پیروات^[۲۷۶] تبدیل می گردد که یک ترکیب واسطه برای تشکیل اجزای سلولی است [۱۱۶]. شکلهای ۴-۱ و ۴-۲ رشد باکتری لانگالی را روی فروکتوز و گلوکز و مصرف این سوبستراها را نشان می دهند.
شکل ‏۴‑۱: دانسیته سلولی، مصرف سوبسترا و تولید محصول در لانگالی رشد داده شده با فروکتوز
▼: فروکتوز، ♦: دانسیته سلولی، ▲: استات، ■: اتانول و ●: استون
شکل ‏۴‑۲: دانسیته سلولی، مصرف سوبسترا و تولید محصول در لانگالی رشد داده شده با گلوکز
▼: گلوکز، ♦: دانسیته سلولی، ▲: استات، ■: اتانول و ●: استون
همان طور که در این شکلها مشاهده می گردد، مصرف فروکتوز و گلوکز توسط باکتری بسیار سریع بود. در مدت زمان ۲۴ ساعت، میزان تبدیل^[۲۷۷] ۸۹ و ۷۹% برای فروکتوز و گلوکز حاصل گردید. بازده رشد لانگالی روی این سوبستراها به ترتیب ۴۶/۴۵ و ۸۲/۴۱ گرم سلول به ازای هر مول فروکتوز و گلوکز بوده است.
باکتری لانگالی این توانایی را دارد که هم اتانول را به عنوان سوبسترا برای رشد سلول مصرف کند و هم اینکه آن را به عنوان محصول متابولیکی در طی فرایند تخمیر تولید کند [۲۸, ۴۶]. فرایند مصرف اتانول و تولید آن توسط لانگالی از طریق مسیرهای متابولیکی مختلف به واسطه استیل-کوآنزیم A و استالدهید انجام می گیرد [۲۸]. رشد باکتری لانگالی روی اتانول در شکل ۴-۳ نشان داده شده است. مصرف اتانول به عنوان سوبسترا در مقایسه با فروکتوز و گلوکز به کندی صورت گرفته و تا ۹۶ ساعت ادامه یافت. در آزمایش ناپیوسته کشت باکتری روی اتانول، میزان تبدیل ۵۶% حاصل گردید و بازده رشد باکتری ۷۶/۳ گرم سلول به ازای هر مول اتانول بوده است.

شکل ‏۴‑۳: دانسیته سلولی، مصرف سوبسترا و تولید محصول در لانگالی رشد داده شده با اتانول
♦: دانسیته سلولی، ▲: استات، ■: اتانول و ●: استون
بر اساس گزارشهای پیشین [۱۰۳]، در هنگام کشت باکتری لانگالی روی استات سدیم هیچ رشدی مشاهده نگردید، اما نتایج این بررسی نشان داد که باکتری لانگالی می تواند استات را به عنوان سوبسترای آلی مصرف کرده و رشد کند. رشد لانگالی روی استات در شکل ۴-۴ نشان داده شده است. مصرف استات مدت کوتاهی پس از تلقیح آغاز شده و پس از رسیدن به میزان تبدیل ۶۲% در زمان ۲۴ ساعت، مصرف استات متوقف گردید. در این آزمایش، بازده ۶۲/۵ گرم سلول به ازای هر مول استات حاصل شد.
شکل ‏۴‑۴: دانسیته سلولی، مصرف سوبسترا و تولید محصول در لانگالی رشد داده شده با استات
♦: دانسیته سلولی، ▲: استات، ■: اتانول و ●: استون
مسیر متابولیکی پیشنهاد شده برای لانگالی
در فرایند تخمیر، استیل-کوآنزیم A تولید شده وارد مسیر کاتابولیکی می شود تا ATP تولید کند و بدین ترتیب انرژی لازم برای بقاء سلول را فراهم سازد. در مسیر کاتابولیکی، استیل-کوآنزیم A به عنوان ماده اولیه برای سنتز اسیدهای چرب فرار و الکلها مصرف می شود. در فرایند رشد ناپیوسته استوژنها، باکتری فرایند تخمیر دو فازی از خود نشان می دهد که شامل فازهای استوژنیک (تولید اسید) و سالونتوژنیک (تولید حلال) است [۱۱۷]. باکتری اسیدهای چرب فراری مانند استات را در مراحل اولیه رشد نمایی تولید می کند. هنگامی که میزان اسید موجود در محیط به حد آستانه^[۲۷۸] رسید و pH محیط کاهش یافت، مسیر متابولیکی باکتری کمی قبل از ورود به فاز سکون به سمت تولید حلال، عمدتا اتانول، تغییر می کند. مسیر متابولیکی پیشنهاد شده برای رشد هتروتروفیک باکتری لانگالی و تولید محصول توسط آن در شکل ۴-۵ ارائه گردیده است.
شکل ‏۴‑۵: مسیر متابولیکی پیشنهاد شده برای رشد هتروتروفیک باکتری لانگالی و تولید محصول
آنزیمهایی که در واکنشها دخالت دارند به اختصار عبارتند از: ACACCT: استیل-کوآنزیم A: استواستیل-کوآنزیم A ترنسفراز^[۲۷۹]، ACAT: استیل-کوآنزیم A استیل ترنسفراز^[۲۸۰]، ACS: استیل-کوآنزیم A سنتتاز^[۲۸۱]، ADC: استواستات دی کربوکسیلاز^[۲۸۲]، ADH: استالدهید/الکل دی هیدروژناز^[۲۸۳]، AK: استات کیناز^[۲۸۴]، BCDH: بوتیریل-کوآنزیم A دی هیدروژناز^[۲۸۵]، BHBD: بتا-هیدروکسی بوتیریل-کوآنزیم A دی هیدروژناز^[۲۸۶]، BK: بوتیرات کیناز^[۲۸۷]، Crt: کروتوناز^[۲۸۸]، PFOR: پیروات:فردوکسین اکسیدورداکتاز^[۲۸۹]، PTA: فسفوترانس استیلاز^[۲۹۰]، PTB: فسفوترانس بوتیریلاز^[۲۹۱]، SADH: الکل دی هیدروژناز ثانویه^[۲۹۲]
همان طور که قبلا اشاره شد، گلوکز و فروکتوز از طریق مسیر میکروبی گلیکولایسیس به پیروات تبدیل می گردند. پیروات تولید شده توسط آنزیم پیروات: فردوکسین اکسیدورداکتاز به استیل-کوآنزیم A، CO₂ و فردوکسین کاهش یافته تبدیل می گردد [۲۸]. مصرف اتانول به عنوان سوبسترا از طریق آنزیم استالدهید/الکل دی هیدروژناز^[۲۹۳] در دو مرحله انجام می گیرد که در آن ابتدا اتانول به استالدهید و سپس به استیل-کوآنزیم A تبدیل می شود [۲۸]. استات به عنوان سوبسترای آلی می تواند مستقیما در حضور آنزیم استیل-کوآنزیم A سنتتاز^[۲۹۴] به استیل-کوآنزیم A تبدیل شده و یا به صورت غیر مستقیم ابتدا توسط آلدهید اکسیدورداکتاز^[۲۹۵] و با فردوکسین کاهش یافته به استالدهید کاهیده شده و سپس به استیل-کوآنزیم A تبدیل شود. با توجه به اینکه مصرف استات بسیار سریعتر از اتانول بود، چنین فرض شد که استات مستقیما به استیل-کوآنزیم A تبدیل می شود.
استیل-کوآنزیم A تولید شده که در تقاطع مسیر کاتابولیکی و آنابولیکی قرار دارد یک ماده اولیه ایده ال برای سنتز اجزای سلولی و همچنین اتانول و استات است. در مسیر کاتابولیکی، استیل-کوآنزیم A (CH₃COS-CoA) ابتدا توسط آنزیم فسفوترانس استیلاز^[۲۹۶] به ترکیب واسطه استیل-فسفات(CH₃COO-P₃^2-) تبدیل می گردد[۱۱, ۷۴] :
CH₃COS-CoA + Pi → CH₃COO-P₃^2- + HS-CoA (4-1)
سپس، استیل-فسفات به استات تبدیل می شود در حالیکه یک مولکول ADP در حضور آنزیم استات کیناز^[۲۹۷] به ATP فسفریله می شود [۷۴]:
CH₃COO-P₃^2- + ADP → CH₃COOH + ATP (4-2)
برای تولید اتانول، NADH توسط ارگانیزم مصرف می شود تا در حضور آنزیم استالدهید دی هیدروژناز^[۲۹۸]، استالدهید (CH₃CHO) تولید کند [۱۱]:
CH₃COS-CoA + NADH + H⁺ → CH₃CHO + NAD⁺ + HS-CoA (4-3)
CH₃CHO + NADH + H⁺ → CH₃CH₂OH + NAD⁺ (۴-۴)
در نهایت، آنزیم الکل دی هیدروژناز^[۲۹۹] استالدهید را به اتانول تبدیل می کند. مسیر متابولیکی تبدیل استیل-کوآنزیم A به محصولات نهایی برای بیشتر استوژنها مسیر شناخته شده ای است.
تولید محصول
رشد ناپیوسته باکتری لانگالی با تولید استات و اتانول و مقادیر بسیار کمی استون مطابق واکنش زیر همراه بود:
Fructose or Glucose + 2ADP +2P_i → ۲ethanol + 2ATP + 2CO₂ (۴-۵)
Fructose or Glucose + 3ADP + 3Pi → ۳acetate + 3ATP (4-6)
توزیع محصولات نهایی هنگام رشد لانگالی روی فروکتوز در شکل ۴-۱ نشان داده شده است. در فاز نمایی رشد سلول، استات تولید گردید و سپس مسیر متابولیکی به سمت تولید حلال، عمدتا اتانول و مقادیر جزئی استون شیفت پیدا کرد. در ۶ ساعت اول فرایند تخمیر، کاهش شدیدی در pH محیط کشت از ۹/۵ تا ۵/۴ ایجاد شد که به تولید اسید مربوط می شد. پس از گذشت ۲۴ ساعت، غلظت استات در محیط به ۵/۲۴ میلی مول در لیتر رسید و تقریبا در طول فرایند تخمیر ناپیوسته ثابت باقی ماند. تولید اتانول در فاز رشد نمایی آغاز گردیده و در فاز سکون رشد سلول به میزان قابل توجهی افزایش یافت. با توجه به مسیر متابولیکی استیل-کوآنزیم A، تولید اتانول موجب افزایش مصرف ATP می گردد و در نتیجه موجب رشد سلول نخواهد شد [۴۵, ۵۴]. بنابراین، تولید اتانول در شرایط عدم رشد^[۳۰۰] افزایش می یابد. حداکثر میزان اتانول تولید شده با فروکتوز، ۱/۲۷ میلی مول در لیتر بود که پس از ۱۲۰ ساعت حاصل گردید.
شکل ۴-۲ پروفایل تولید استات، اتانول و استون را برای باکتری لانگالی رشد داده شده با گلوکز نشان می دهد. با وجود آنکه دانسیته سلولی بالایی در فاز سکون حاصل گردید اما تولید اتانول توسط سلولها قابل توجه نبود (کمتر از ۶/۵ میلی مول در لیتر). مقادیر بسیار کمی استون نیز در محیط کشت تولید شد. در مقابل، غلظت بالایی از استات (۸/۴۴ میلی مول در لیتر) به عنوان محصول اصلی حاصل گردید. در زمان ۷۲ ساعت، تولید اتانول متوقف شده و غلظت استات در محیط افزایش یافت که می توانست نشانه ای از تغییر مسیر متابولیکی باکتری از فاز سالونتوژنیک به فاز استوژنیک باشد. این مساله تغییر فاز احتمالا به نیاز سلولها به ATP مربوط می شد که موجب افزایش تولید استات گردید. نتایج به دست آمده نشان می دهد که لانگالی گلوکز را عمدتا به استات متابولیز کرد و جریان کربن کمی از گلوکز به اتانول وجود داشت.
تاثیر اتانول به عنوان سوبسترای آلی روی توزیع محصول باکتری لانگالی در محیط کشت ناپیوسته مطالعه گردید و نتایج این بررسی در شکل ۴-۳ ارائه شده است. پس از مصرف اولیه اتانول توسط سلولها، مصرف اتانول متوقف شده و مقدار کمی استات در محیط کشت تولید شد. مقدار استات تولید شده به اندازه ای کم بود (۷/۲ میلی مول) که نتوانست pH محیط کشت را به صورت مطلوبی کاهش دهد. از آنجا که سلولها همچنان در pH رشد (۷-۵) بودند، مقدار بیشتری از اتانول به عنوان سوبسترا در زمان ۷۲ ساعت مصرف گردید. سپس، تولید اتانول همزمان با ورود سلولها به فاز سکون رشد آغاز گردیده و ۲۵ میلی مول در لیتر اتانول در زمان ۱۲۰ ساعت در محیط کشت تولید گردید. تولید اتانول از طریق استیل-کوآنزیم A و مصرف معادلهای کاهنده (NADH) انجام گرفت تا در حضور آنزیم استالدهید دی هیدروژناز، استالدهید تولید شده و سپس استالدهید توسط آنزیم الکل دی هیدروژناز به اتانول تبدیل گردد. استات تولید شده نیز می توانست توسط آنزیم آلدهید اکسیدورداکتاز و همراه با فردوکسین کاهش یافته به استالدهید کاهیده شده و در نهایت به اتانول تبدیل شود [۲۸].
توزیع محصولات در هنگام رشد لانگالی روی استات در شکل ۴-۴ ارائه گردیده است. استات به عنوان سوبسترای آلی برای رشد سلول استفاده گردید. هرچند، تولید استات پس از ۲۴ ساعت متوقف گردیده و تولید اتانول آغاز شد. اتانول و مقادیر جزئی استون تنها متابولیتهای فرایند تخمیر استات بودند. محتمل ترین مسیر متابولیکی برای این انجام این فرایند، تبدیل استات به استیل-کوآنزیم A و سپس کاهش آن به اتانول مطابق واکنش زیر بود [۱۱۸]:
Acetate + 2NADH + ATP→ Ethanol + 2NAD⁺ + ADP + Pi (4-7)
با وجود آنکه حضور استات در محیط کشت موجب تغییر مسیر متابولیکی سلولها به سمت فاز تولید حلال گردید اما تولید اتانول قابل توجه نبود (۵/۳ میلی مول در لیتر). اندازه گیری تغییرات pH محیط کشت در طول فرایند تخمیر نشان داد که پس از گذشت زمان ۲۴ ساعت، pH از ۹/۵ به حدود ۸/۶ افزایش یافت که این pH برای تولید اتانول مناسب نبود. بر اساس گزارشهای پیشین [۷۸]، pH حدود ۵/۴-۴ که شرایط عدم رشد سلولها را ایجاد می کند pH مناسبی برای تولید اتانول توسط لانگالی است.
خلاصه ای از عملکرد باکتری لانگالی با سوبستراهای مختلف بر اساس بازده مصرف سوبسترا، رشد سلول و تولید محصول در جدول ۴-۱ ارائه گردیده است. بیشترین بازده تولید سلول از سوبسترا (۴۶/۴۵ Y_X/S= گرم بر مول) و میزان تبدیل سوبسترا (۶۹/۸۸%) با فروکتوز حاصل شد. همچنین استفاده ار فروکتوز به عنوان سوبسترا منجر به تولید اتانول و استات با نسبت مولی یکسان (۰۳/۱ EtOH/Ac=مول به مول) گردید. بازده تجربی تولید محصول با گلوکز (۲۹/۲Y_P/S,_exp= مول به مول) به مقدار تئوری آن (۶/۲= Y_P/S,_thمول به مول) نزدیک بود اما استات محصول نهایی غالب بود و فقط مقدار بسیار کمی اتانول در محیط کشت تولید شد (۱۲/۰ EtOH/Ac= مول به مول). رشد باکتری روی اتانول کند و ضعیف بود (۷۶/۳ Y_X/S=گرم بر مول) اما بازده تولید محصول از بیومس (۸۹/۱۱۷Y_P/X= میلی مول به گرم) نسبتا قابل توجه بود. با وجود آنکه نسبت بالایی از اتانول به استات (۶۵/۱۶ EtOH/Ac=مول به مول) با این سوبسترا تولید شد اما میزان اتانول تولید شده (۲۵ میلی مول در لیتر) در مقایسه با اتانول مصرف شده (۶۰ میلی مول در لیتر) در آزمایش ناپیوسته ۱۲۰ ساعته نسبتا کم بود. استات برای تولید محصول اصلا مناسب نبود (۰۷/۰ Y_P/S,_exp=مول به مول) و تنها می توانست تا حدودی باعث رشد باکتری شود (۶۲/۵ Y_X/S=گرم بر مول). نتایج به دست آمده نشان داد که فروکتوز بهترین سوبسترای آلی برای رشد سلول و تولید محصول بود.
جدول ‏۴‑۱: بازده مصرف سوبسترا، رشد سلول و تولید محصول در باکتری لانگالی رشد داده شده با سوبستراهای آلی مختلف