۳-۸-تهیه باکتری مستعد شده
سلول مستعد سلولی است که توانایی ترانسفورم شدن با یک قطعه DNA خارجی را داشته باشد. برخی باکتری ها در مرحله بین رشد لگاریتمی و فاز ثابت به طور خود به خود مستعد دریافت ژن می‌شوند، اما باکتری E.coli را می‌توان طی مراحلی به طور مصنوعی به سلول مستعد تبدیل کرد. به این منظور طی یک سری فرایندهای متوالی ، غشای باکتری دارای سوراخ‌های بسیار ریزی می‌شود که پذیرش DNA را آسان می کند. در این پروتوکل از کلرید کلسیم ۰٫۱ مولار استفاده می شود.
مواد و وسایل مورد نیاز:
سلول باکتری (در اینجا E.coli سویه BL21 )
محیط کشت LB مایع (برای یک لیتر)
( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
Trypton یا Bactopepton 10 گرم
Yeast Extract 5 گرم
NaCl 10 گرم
در آب دیونیزه به کمک مگنت حل و پس از به حجم رساندن با اتوکلاو استریل گردید.
محلول کاری CaCl2 0.1M است لذا در هنگام تهیه سلول های مستعد باید به نسبت ۱:۱۰ با آب دیونیزه رقیق شود.این کا ردر شرایط کاملا استریل انجام گردید.
اسپکتروفوتومتر
سانتریفوژ ۴ درجه سانتی گراد و انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد شیکردار
سمپلر،سر سمپلر و لوله اپندورف استریل
ظرف یخ
روش کار:
تک کلونی باکتری پس از انتخاب از روی محیط LB آگار دار و انتقال به ۵ml محیط LB مایع به مدت یک شب در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه گردید.
به ۵۰ml محیط LB موجود در یک بالن استریل Mg2+ با غلظت ۱۰ میلی مولار اضافه شده و جهت اطمینان از عدم آلودگی یک شب در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه می گردد.
از محیط کشت داده شده به نسبت ۱ به ۱۰۰(۰٫۵ml) به ۵۰ml محیط حاوی Mg2+ تلقیح شده و تا زمانی که جذب نوری محیط در طول موج ۵۵۰ نانومتر (OD550) به میزان ۰٫۵-۰٫۳ برسد(حدود ۳ ساعت)، بالن حاوی محیط کشت در اتوشیکردار، در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و با دور ۱۶۰rpm انکوبه گردید. توجه به این نکته ضروری است که اگر OD بیش از ۰٫۶۵ شود کارائی ترانسفورماسیون کاهش خواهد یافت.
سپس محتوای بالن به یک لوله پلی پروپیلن (فالکون) استریل که از قبل سرد شده باشد منتقل شده و به مدت ۱ ساعت در یخ انکوبه گردید.
پس از این مرحله سلول ها توسط سانتریفوژ در دمای ۴ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۳۰۰۰-۲۰۰۰ رسوب داده شده و به دنبال برداشتن کامل مایع رویی، رسوب در ۱٫۱۶ حجم اولیه (۲٫۵ml)بافر سرد کاملا حل شده و به طور استریل به میزان ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های میکروفیوژ (اپندورف) از قبل سرد شده ،در روی یخ تقسیم می شوند پس از تقسیم سلول های حساس در لوله های میکروفیوژ باید بلافاصله آنها را در ازت مایع یا دمای ۷۰- درجه سانتی گراد و در صورت موجود نبودن در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد قرار داده و نگهداری کرد. به این ترتیب برای مدت ۲-۱ ماه این سلولها مستعد دریافت ژن می باشند.
۳-۹-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی
مواد مورد نیاز:
- سلول صلاحیت دار (در اینجا E.coli سویه BL21 )
- پلاسمید بیانی
- محیط کشت LB مایع
- محیط کشت LB آگار (برای ۱ لیتر)
Trypton یا Bactotryptone 10 گرم
Yeast Extract 5 گرم
NaCl 10 گرم
Agar 15 گرم
در آب دیونیزه به کمک مگنت حل و پس از به حجم رساندن با اتوکلاو استریل شد.
- آنتی بیوتیک مناسب(در اینجا کانامایسین ۱۰۰µg/ml)
به این منظور با حل کردن ۱g کانامایسین در ۱۰ml آب مقطر استریل تزریقی یک استوک با غلظت ۱۰۰mg/ml تهیه کرده و به ازای هر۱ml از محیط کشت مقدار۱gl از استوک آنتی بیوتیک اضافه می شود.
- لوله اپندورف و سر سمپلر استریل
Heat block با دمای ۴۲ درجه سانتی گراد و انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد
روش کار:
در ابتدا با افزودن آنتی بیوتیک مناسب (در اینجا کانامایسین به منظور انتخاب سلول های ترانسفورم شده با پلاسمید های نوترکیب )، به LB آگار ذوب شده ،۳ عدد پلیت حاوی محیط جامد اضافه شد.
سلول های مستعد به منظور ذوب تدریجی روی یخ قرار گرفته شد.
پلاسمید به اپندورف حاوی سلول های صلاحیت دار افزوده شد و به آرامی مخلوط گردید.
مخلوط حاصل را به مدت ۳۰ دقیقه روی یخ قرار گرفت.
اپندورف مذکور به heat block با دمای ۴۲ درجه سانتی گراد و به مدت ۹۰ ثانیه منتقل گردید (شوک حرارتی)، سپس بلافاصله ۱ دقیقه روی یخ قرار گرفت.
به مخلوط فوق۱ml محیط LB مایع اضافه شد ، سپس به مدت ۱ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار گرفت.
*تمام این مراحل عینا برای نمونه کنترل منفی نیز انجام شد.
نمونه حاوی سلول های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب و کنترل منفی روی پلیت های حاوی محیط جامد کشت داده شد.
۱۰۰µl از سوسپانسیون میکروبی حاصل روی پلیت کاملا پخش شد و مابقی به مدت ۵ دقیقه در ۳۰۰۰rpm سانتریفوژ شد. سپس محلول رویی دور ریخته شد و تقریبا ۱۰۰µl از این محلول غلیظ شده روی پلیت دیگر و به طور مشابه کشت داده شد. ۱۰۰µl از نمونه کنترل منفی نیز به طریق مشابه روی یک پلیت کشت داده شد.
پس از جذب سوسپانسیون میکروبی توسط محیط کشت ، پلیت ها را وارونه نموده ، برای تمام شب در ۳۷ درجه سانتی گراد وارونه شد. روز بعد پلیت ها جهت ایجاد کلون مشاهده و بررسی می شوند.
*میزان DNA اضافه شده برای ترانسفورم حداکثر ۵۰ng (10-50 ng) و به طور کلی نباید از ۱۰ µl بیشتر شود . بنابر این میزان پلاسمید اضافه شده بستگی به غلظت آن دارد.
*در فرایند ترانسفورماسیون قرارگیری روی یخ باعث کاهش سیالیت غشا باکتری می شود و شوک حرارتی نفوذپذیری غشا را افزایش می دهد.
*در صورتی که پلیت ها از قبل تهیه شده و در یخچال نگهداری شده اند لازم است قبل از کشت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار گیرند تا گرم شوند.
*کلیه مراحل در زیر هود و شرایط کاملا استریل انجام می شود.
*باکتری فاقد ژن مقاومت به آنتی بیوتیک است. بنابراین غربالگری سلول های ترانسفورم شده با ظهور کلونی بر روی پلیت حاوی آنتی بیوتیک انجام می گیرد.
